Анализ ИФА — что это такое: иммуноферментный анализ крови

Иммуноферментный анализ сыворотки крови

С развитием таких смежных наук, как генетика, молекулярная биология, химия, а также ростом технического прогресса, современная медицина может похвастаться инновационными методами диагностики самых разных заболеваний человека. Они отличаются высокой точностью результатов и безопасностью проведения. Одним из таких способов выявления проблем со здоровьем является иммуноферментный анализ.

Он приобрел широкую популярность в последнее десятилетие и завоевал репутацию высокоэффективного, надежного и безопасного для пациента метода обнаружения заболеваний еще до появления внешних симптомов. Мы доступно объясним, что представляет собой такой вид диагностики, каков принцип его действия, отметим достоинства, сориентируем в стоимости такого анализа.

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса

(2 недели от инфицирования)

( 2,5 — 3 недели от инфицирования)

( 3-4 недели от инфицирования)

Обострение хронической фазы

( 2 недели от начала обострения)

Прошедшая (излеченная инфекция)

Анализ ИФА - что это такое: иммуноферментный анализ крови

снижение титра в 2-4 раза после успешного лечения

снижение титра в 4-8 раз через 1-1.5 мес после успешного лечения

К сожалению,такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе — т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Расшифровка результатов анализа может принимать такие значения:

  • JgM (-), JgG (-), JgA (-) – отсутствие иммунитета к инфекции;
  • JgM (-), JgG ( ), JgA (-) – наличие поствакционного или постинфекционного иммунитета;
  • JgM ( ), JgG (-/ ), JgA (-/ ) – наличие острой инфекции;
  • JgM ( ), JgG ( ), JgA ( ) – наличие обострения хронической инфекции;
  • JgM (-), JgG ( /-), JgA ( /-) – наличие хронической инфекции;
  • JgM (-) – выздоровление.

В расшифровке ( ) является положительным результатом, а (–) – отрицательным результатом.

Помимо уточнения классов антител в расшифровке встречаются количественные их показатели. Но обширное их объяснение может предоставить только лечащий врач.

Сыворотка крови – это прозрачная жидкость с желтым оттенком. После свертывания крови она отделяется от кровяного сгустка. Не содержит фибрина и форменных элементов.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови основан на взаимодействии антигена с антителом, причем один из них содержит в своей структуре фермент. При взаимодействии двух компонентов содержимое пробирки должно менять свой цвет. Результаты сравниваются со стандартной цветовой шкалой, и далее устанавливается антиген, который присутствует в материале. Другими словами принцип иммуноферментного анализа сыворотки крови можно объяснить так:

  1. подготавливаются наборы антигенов (например, возбудители инфекционных заболеваний, аллергены или гормоны);
  2. пациент сдает кровь на анализ, из которой в лаборатории выделяется сыворотка;
  3. материал для исследования добавляется в лунки готовых наборов, после чего возникает реакция антиген-антитело;
  4. оставшаяся сыворотка крови убирается, а обнаруженные антитела распознаются при помощи индикаторов.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови считается достоверным. Но в тех случаях, когда произошло неправильное взятие крови для анализа, или была нарушена техника проведения исследования, или же имеются у человека скрытые системные заболевания, результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови могут оказаться ложными.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови исследует практически все гормоны щитовидной железы, онкомаркеры и различные виды инфекций.

К гормонам щитовидной железы относятся тиреоглобулин (ТГ), тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3), свободный тироксин (Т4), свободный трийодтиронин (Т3).

Иммуноферментный анализ крови в норме считается, если присущи такие допустимые нормы гормонов щитовидной железы:

  • тиреоглобулин (ТГ) – допустимые границы 70 МЕ/мл;
  • тироксин (Т4) – 64-146 нмоль/л (50-113 нг/мл);
  • трийодтиронин (Т3) – 1,8-2,8 нмоль/л (0,8-2,0 нг/мл);
  • свободный тироксин (Т4) – 11-25 пмоль/л (10-27 пг/мл);
  • свободный трийодтиронин (Т3) – 4,49-9,3 пмоль/л (2,5-5,8 пг/мл).

В случае исследования половых гормонов иммуноферментный анализ крови в нормедля женщин считается, если в организме выделяется лютеинизирующий гормон (ЛГ) в таких пределах:

  • фолликулярная фаза цикла (с первого дня месячных до двенадцатого-четырнадцатого) – 2-14 мЕд/л;
  • овуляционная фаза цикла (с двенадцатого дня по четырнадцатый день) – 24-150 мЕд/л;
  • лютеиновая фаза цикла (с пятнадцатого-шестнадцатого дня и до начала следующих месячных) – 2-17 мЕд/л.

В норме для мужчин принимается, если половой гормон вырабатывается в пределах 0,5-10 мЕд/л.

При исследовании хронического гонадотропина (ХГ) референсные значения зависят от пола человека.

  • У взрослых мужчин и небеременных женщин нормой считается уровень ХГ ниже 5мЕд/мл.
  • У беременных женщин результат зависит от срока беременности и может колебаться в пределах 25-49000 мЕд/мл.

Иммуноферментный анализ крови исследует множество онкологических показателей. К ним можно отнести наличие пролактина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, стероид связывающего глобулина (ССГ) и других маркеров. Но интерпретация результата анализа и норм этих показателей должна проводиться только лечащим врачом.

Кроме того, данный метод диагностирует инфекционные (например, краснуха, корь, туберкулез, герпес, сифилис, гепатит, псевдотуберкулез) и аутоиммунные заболевания разного вида, а также устанавливает иммунный статус человека. Но все показатели и полученные результаты должны расшифровываться квалифицированным специалистом.

После того как мы разобрали аббревиатуру ИФА и что это такое ─ выяснили, стоит перейти к трактовке результатов. Здесь важно понимать, что если анализ проводили качественный, то результат будет лишь положительным или отрицательным. То есть диагностика либо подтверждает подозрения доктора относительно определенного диагноза, либо опровергает их. В этом случае в бланке будут стоять символы « » или «-» соответственно.

В случае же если проводится количественный анализ, то здесь определяется вид антител, их количество и стадия активности. В частности при такой диагностике определяют антитела (иммуноглобулины) IgG и IgM, которые формируются в разные периоды прогрессирования инфекции. Самыми распространенными вариантами результатов в этом случае являются:

  • Повышенный IgМ и полное отсутствие IgG. Такая картина свидетельствует о недавнем инфицировании и острой фазе течения патологии.
  • Повышенная активность иммуноглобулинов обоих видов (IgМ и IgG). Говорит о давнем и хроническом протекании инфекционного процесса.
  • Активность IgG и полное отсутствие IgМ. Инфицирование было не менее полугода назад и сейчас вирус пребывает в затяжной хронической стадии.
  • Отсутствие антител IgG и IgA. Результат не определен.
  • Отсутствие антител IgM, IgA и IgG. Свидетельствует об отсутствии иммунитета к определенной инфекции.
  • Активность антител IgG, IgM и IgA говорит об обострении хронического процесса.

Помимо выявления типов антител лаборант в специальной графе бланка указывает и их количество на объем крови. Помните, разобравшись в том, что такое метод ИФА, не трактуйте результаты самостоятельно. Полученные результаты с точностью может интерпретировать только лечащий врач в зависимости от предполагаемого диагноза, выстраиваемого на основании клинической картины у пациента.

Подготовка к анализу на паразитов

Важно понимать, что выявление паразитов через анализ крови требует определенной подготовки от пациента. Так, перед сдачей крови необходимо сделать следующее:

  • За сутки до забора биоматериала нужно исключить из рациона жирную пищу, алкоголь и копчености;
  • Кровь на иммуноферментный анализ крови на паразитов и другие инфекции следует сдавать с утра натощак;
  • Перед сдачей крови запрещено курить минимум за 3-4 часа;
  • В день забора крови желательно не нервничать и не прибегать к усиленным физическим нагрузкам.

Соблюдение этих правил позволит избежать ложноположительного результата на антитела к паразитам.

Иммуноферментный анализ следует проводить, придерживаясь всех рекомендаций, так как на результаты исследования влияют внешние факторы. Например, важно сдавать венозную кровь натощак утром (до 11 часов). За 2 недели до предполагаемого забора материала нужно прекратить прием каких-либо лекарственных препаратов, особенно гормональных.

Реакция организма на патогенную флору

Для того чтобы понять, как, благодаря иммуноферментному анализу, лаборанты диагностируют различные заболевания, необходимо разобраться в физиологическом процессе, который происходит в организме во время заражения инфекциями. Когда патогенный микроорганизм попадает в кровоток, иммунная система человека демонстрирует защитную реакцию в виде выделения определенных веществ – антител.

Антитела бывают разных видов, имеют свои особенности. Одни вещества появляются непосредственно в период инфицирования, другие остаются в течение всей жизни в организме человека и именно благодаря им вырабатывается стойкий иммунитет к конкретному заболеванию. Рзделяют белковые структуры на такие виды: A, D, E, M, G. В медицине антитела называют иммуноглобулинами. Поэтому принято обозначать показатели этих веществ латинскими буквами Ig.

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан именно на данных медицинских знаний. С помощью специальных антигенов в лабораторных условиях можно определить наличие или отсутствие тех или иных антител в биологическом материале. По результатам такого анализа врач может поставить диагноз, а также определить не только наличие патологии, но и давность ее происхождения, выявить уровень опасности для пациента. При иммуноферментном анализе чаще других исследуют наличие антител групп M и G.

Что представляет собой ИФА?

На самом деле иммуноферментный анализ не является инновацией современного общества. Его изобрели еще в 80-х годах. Но для проведения таких исследований требовалась громоздкая дорогостоящая аппаратура. Поэтому использовали такой метод только в специально оснащенных научных лабораториях: его применяли для типирования клеток и тканей.

А вот широкого распространения в диагностической медицине он тогда не получил, использовать его было технически сложно и крайне затратно. Лишь с развитием техники и изобретением биополимерных материалов ИФА усовершенствовали. После чего метод стал популяризироваться и завоевывать доверие в медицинских кругах.

Как уже было сказано выше, данный метод подразумевает обнаружение в биоматериале — крови, околоплодных водах, стекловидном теле или спинномозговой жидкости — определенных групп иммуноглобулинов.

Анализ ИФА - что это такое: иммуноферментный анализ крови

Различают исследования без нанесения антигена на поверхность и твердофазный иммуноферментный анализ, который предполагает проведение реакции в специальных лунках. Последний метод имеет большую чувствительность и надежность, поэтому именно таким образом проводят анализ в медицинских лабораториях для обнаружения заболеваний человека.

Ферментативная реакция

Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов – иммунной реакции и ферментативной реакции. Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции.

То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками. Исходя из такой структуры метода иммуноферментного анализа, разберем обе его части по отдельности.

В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции.

– это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются

. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).

Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?

Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!

Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.

Анализ ИФА - что это такое: иммуноферментный анализ крови

Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».

Как происходит узнавание антигена?

Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет.

Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!Что такое антитело, иммунный комплекс?А что представляет собой антитело?

Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.

иммуноферментный анализ крови

Что такое иммунный комплекс?При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном.

Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак, антитела = иммуноглобулины.

Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.

Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.

Перейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.

Что такое ферментативная реакция?

Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.

лечащий врач

Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества.

При данном виде анализа крови устанавливаются антитела разных видов – это иммуноглобулины класса M, A, G (JgM, JgA, JgG). Их накопление происходит в различные временные промежутки. Первыми начинают проявляться иммуноглобулины класса М (пятый день после начала болезни). Такие иммуноглобулины задерживаются в организме пять-шесть недель, после чего начинают исчезать из крови организма. Именно в данный период времени выявляются антитела класса М.

Вторыми проявляются иммуноглобулины класса G (через три-четыре недели). Они задерживаются в организме несколько месяцев или лет. Во время проведения иммуноферментного анализа крови и расшифровки его результата можно обнаружить возрастание антител класса G. Это свидетельствует о наличии инфекции или реинфекции.

Антитела класса А проявляются в крови на протяжении двух-четырех недель. Но всего лишь 20% из них присутствуют в сыворотке крови. Остальные же входят в состав секрета слизистых оболочек. Иммуноглобулины класса А начинают исчезать в промежутке времени от двух недель до двух месяцев. Данный процесс является свидетельством уничтожения инфекции в организме.

Для визначення опору навантаження R, при якому в ньому виділяється максимальна потужність, потрібно дослідити функцію на екстремум (максимум). Максимум функції буде при мінімумі знаменника, який знайти простіше.

Звідки: — умова виділення максимальної потужності.

Очевидно, при виділенні в навантаженні максимальної потужності , h=0.5. При великих потужностях (електричні мережі), працювати з таким ККД неприпустимо, оскільки половина потужності буде передаватись до наванта-ження, а інша половина витрачатись. Але при малих потужностях (декілька мі-ліват), в різних пристроях радіоелектроніки і автоматики працюють з ККД h = 0.5 для того, щоб до навантаження надходила максимальна потужність.

Вибір опору навантаженняR, що дорівнює вхідному опору активного двополюсника, називають узгодженням навантаження. Залежність потужності на опорі навантаження від значення цього опору P=f(R)показана на Рис. 48.

Настоящий материал посвящен современным методам иммуноанализа, основанным на применении высокоактивной и специфичной метки — маркера, позволяющего непосредственно обнаружить продукт иммунной реакции. Такие методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, требуют минимального количества биоматериала, позволяют получить количественные, объективные результаты, позволяют осуществлять скрининг или диагностику на ранних стадиях заболевания при минимальных изменениях в организме или объекте исследования.

Эти методы явились результатом эволюции ранних методов иммуноанализа, в которых иммунная реакция обнаруживалась по визуальному изменению состояния реагентов (агглютинация, преципитация, пассивная агглютинация), либо по характерному изменению биообъектов, добавляемых к реакционной смеси для выявления протекания реакции (РСК).

Ситуация изменилась в 50-ых годах прошлого столетия (рисунок 1) после разработки и публикации метода определения инсулина (Berson S.A. et Yalow R.S.), основанного на конкурентном радиоиммунном анализе (РИА).

Вскоре (В 60-ых годах) были разработаны принципы применения меченных изотопами антител для иммуноанализа, «сэндвич»- и твердофазный радиоиммуноанализ (радиоаллергосорбентный тест (РАСТ, Wide L.); иммунорадиометрический анализ (ИРМА, Mile L., Hales C.N.)). Немного позже был предложен иммуноферментный анализ (ИФА, Engvall E., Perlmann P., Rubinstein K и др.).

Рисунок 1. Развитие методов иммуноанализа

Мощный импульс развитию иммуноанализа дала разработка технологии получения моноклональных антител (Milstein С.), после чего стало возможным полномасштабное развитие методов с применением ферментных, флуоресцентных и других меток (флуоресцентный иммуноанализ (ФИА, Etkins К., Wallac О.), хемолюминисцентный иммуноанализ (ХИА), гибридизация, технологии иммуносенсоров (ИС) и микроэрея (МЭ)).

Фазы иммуноферментного анализа

В зависимости от предполагаемого заболевания, из набора для иммуноферментного анализа используют необходимый антиген, который во время химической реакции при наличии инфекции свяжется с патогенной флорой. Этот процесс называется проведением иммунной реакции.

Затем для того, чтобы визуально определить результат исследования, проводят ферментативную фазу ИФА. Она предполагает окрашивание материала с помощью специальных реагентов. В данном исследовании применяют такие ферменты, как щелочная фосфатаза, пероксидаза и авидин. В зависимости от получившегося цвета в процессе проведения химических реакций и определяют результат иммуноферментного анализа.

Метод колориметрии – суть и принцип

применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость.

При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (

подготовка к анализу

Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.

В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.

Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.

Анализ ферментативной фазы диагностики проводится с помощью метода, который имеет название «колориметрия». Дело в том, что не только цвет материала дает информацию об инфекции, но и получившаяся в результате химических реакций плотность окраса. Именно этот показатель определяет концентрацию патогенного микроорганизма. Если по старинке используют ручной метод диагностики, то для определения указанных показателей выстраивают специальный калибровочный график.

Наборы реагентов

Наборы для иммуноферментного анализа выпускают разные производители, в самых разных комплектациях. В России признанной является компания «Союз медико-биологический». Данный производитель выпускает наборы реагентов для исследования методом ИФА практически всех распространенных в наших широтах инфекций, поддающихся анализу таким способом.

Отличаются химико-биологические наборы относительной доступностью, что прямо влияет на распространение и доступность иммуноферментного анализа для населения.

Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?

Несомненно, иммуноферментный анализ имеет ряд преимуществ по сравнению с другими диагностическими методиками:

  1. С его помощью можно определить даже незначительное наличие патогенных организмов, что говорит о высокой чувствительности теста.
  2. Возможность обнаружения заболевания на самых ранних стадиях, что значительно повышает шанс на благополучное излечение.
  3. Простота и удобство взятия биологического материала. Такой анализ проводят как в частных лабораториях, так и в государственных. При необходимости материал может взять медсестра у пациента дома.
  4. Для анализа требуется совсем незначительный объем биоматериала.
  5. Быстрое получение результата. Современное медицинское оборудование позволяет выполнить анализ в течение суток.
  6. Возможность обнаружения скрытых бессимптомных форм инфекции.
  7. Доступность исследования.
  8. При необходимости возможно проведение массовых обследований данным методом.
  9. Существует возможность отслеживания протекания заболевания и эффективности назначенного лечения, так как можно проводить анализ методом ИФА многократно абсолютно безопасно для пациента.
  10. Автоматизация этапов проведения анализа, что исключает человеческий фактор и повышает достоверность результатов.
  11. Реагенты для проведения ИФА хранятся достаточно долго – около года.
  12. Проведение анализа возможно при колебаниях температуры окружающей среды.

Иммуноферментный анализ крови применяют для определения разных инфекционных заболеваний, гормональных состояний, делают аллергопробы. А именно:

  • определяют уровень гормонов щитовидной железы;
  • показатели репродуктивной гормональной панели;
  • онкомаркеры;
  • обнаруживают возбудителей инфекционных заболеваний, таких как цитомегаловирус, гепатит, токсоплазма, краснуха, корь, туберкулез, хламидия, сифилис, микоплазма, уреплазма, кандида, лямблии и даже ВИЧ;
  • диагностируют аутоиммунные заболевания. В том числе часто используют для исследования гормонов щитовидной железы иммуноферментный анализ: ТТГ, ТГ, Т3 и Т4.

Кроме диагностических целей, метод иммуноферментного анализа применяют в научно-исследовательской медицинской деятельности.

В основном в современной венерологии применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями),ВИЧ-инфекции,вирусных гепатитов.Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции,цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций.Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях,уровня гормонов,аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Определение наличия и уровня антител в крови не рекомендуется примененять для первичной диагностики инфекций,передающихся половым путем.Единственное исключение — по результатам ИФА возможно рспознавание сифилиса в комплексе с реакцией микропреципитации .Но необходимо отметить, что наличие антител в сыворотке крови может свидетельствовать только о контакте организма с возбудителем.в настоящее время или в прошлом.

Метод ИФА в диагностике сифилиса был впервые применен в 1975 год.В настоящее время он широко применяется для серологической диагностики сифилиса в России и используется как потверждающий тест на сифилис.Обычно проводят исследование,выявляющее так называемые суммарные антитела к антигенам бледной трепонемы (IgM и IgG),хотя в отдельных случаях возможно и определение только «ранних» антител класса М.

ИФА при сифилисе становится положительным после 3 недели с момента инфицирования и остается положительным довольно длительное время даже после лечения (иногда всю жизнь).Поэтому как тест,подтверждающий излечение сифилиса,ИФА не используется.В большинстве случаев проводится только качественное определение ИФА — т.е. только положительный или отрицательный результат,хотя возможно и количественное определение.

Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.

Гормоны и маркеры заболеваний щитовидной железы Тиреопероксидаза (ТПО)
Тиреоглобулин (ТГ)
Тиреотропный гормон (ТТГ)
Тироксин (Т4)
Трийодтиронин (Т3)
Свободный тироксин (Т4)
Свободный трийодтиронин (Т3)
Диагностика репродуктивной функции Лютеинизирующий гормон (ЛГ)
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)
Хорионический гонадотропин (ХГ)
Пролактин
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
Кортизол
Стероид связывающий глобулин (ССГ)
Альфафетопротеин (АФП)
Онкомаркеры Хорионический гонадотропин (ХГ)
Простатспецифический антиген (ПСА)
СА – 125
СА – 19.9
CYFRA – 21-1
М – 12 (СА – 15.3)
MUC – 1 (M – 22)
MUC1 (M – 20)
Альвеомуцин
К – цепь
L – цепь
Фактор некроза опухолей (ФНОα)
γ – интерферон
Раково-эмбриональный антиген (РЭА)
Диагностика инфекционных заболеваний Токсоплазма (IgG, IgM)
Краснуха (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Герпес (IgG, IgM)
Туберкулез (IgG, IgM)
Корь (IgG, IgM)
Гепатит Д, Е, А (ВГД, ВГЕ, ВГА)
Гепатит С (ат ВГС, ВГСсore)
Гепатит В (НВs, НВе НВсore)
Уреаплазма (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG, IgM)
Хламидия (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG)
Сифилис (IgG)
Аспергиллёз (IgG)
Лямблии (IgG)
Helicobacter Pylori (IgG)
Псевдотуберкулез (IgG, IgM)
Кандида (IgG)
Герпес (IgG, IgM)
Эпштейн-Барр (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Диагностика аутоиммунных заболеваний и определение иммунного статуса IgE – общий
С-реактивный белок (СРБ)
Глиадин (IgG, IgA)
IgG4
Общий IgG
IgG2
Общий IgA
Секреторный IgA
Общий IgD
Общий IgМ
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
Маркеры заболеваний сердца Тропонин I

В таблице приведен далеко не полный перечень анализов (только наиболее распространенные), выполняемых с помощью иммуноферментного анализа. Привести же весь список не представляется возможным, поскольку он будет очень большим и постоянно пополняющимся. Помимо лабораторной диагностики метод иммуноферментного анализа широко используется в научных исследованиях.

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)

Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

I. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течениеминут при комнатной температуре.

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.

При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител — в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000).

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.

Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H2SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой.

В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.

расшифровка результатов

Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом

Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену.

Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.

Удаление «лишних» антител

Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения

Иммуноферментный анализ сыворотки крови

Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт).

Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.

Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.

В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.

Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителомТак же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок.

Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.

Связывание меченого антитела с комплексом антиген немеченое антителоПосле чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело антитело антиген.

Ферментативная реакция – образование окрашенного соединенияПосле чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена.

Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Анализы и лечение. Помощь людям
Adblock
detector