Подсчет ретикулоцитов в мазке крови

Ретикулоцит — это что такое в анализе крови? Показатели нормы и обозначение

(1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;

(2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;

https://www.youtube.com/watch?v=ytcopyrightru

(3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;

(4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;

(5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

• при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах);

• при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом);

• при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 — 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);

• при остром недостатке кислорода;

• при метастазах опухолей в костный мозг.

• включений в эритроцитах (тельца Жолли, малярийные паразиты);

• аномальной формы гемоглобина;

https://www.youtube.com/watch?v=playlist

• при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;

• при анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);

• при сидеробластной анемии;

• при метастазах рака в кость;

• при лучевой болезни и лучевой терапии;

• при лечении цитостатиками;

• при аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;

• при заболеваниях почек;

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertiseru

• при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;

• неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом;

• длительное сдавливание руки жгутом;

• прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);

• переливание крови незадолго до исследования;

• гемолиз пробы крови.

• оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей;

• ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга;

• ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки;

• допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина);

• диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов;

• дифференциальная диагностика анемий;

• детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии;

• оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

• ретикулоциты с низким содержанием РНК , наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);

• ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) — фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);

https://www.youtube.com/watch?v=upload

• ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) — фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);

• незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Ретикулоцит — это предшественник эритроцита, то есть это эритроцит в молодой форме. В крови здорового человека их содержание составляет 0,2-1,2 %. Данное соотношение отражает содержание ретикулоцитов в крови относительно эритроцитов. Созревают они 4-5 дней.

Клетки ретикулоциты при здоровом состоянии организма человека, присутствуют в малых количествах. Основной процент ретикулоцитов в костном мозге человека преобразуются в эритроциты. Весь этот процесс превращения занимает не более 2 дней. Регулирует это преобразование гормон эритропоэтин.

В анализах ретикулоцит обозначается транскрипцией RTC, на латинском языке — Reticulocytes.

RTC (ретикулоциты) выявляет работу костного мозга, а также отмечает уровень выработки в нем эритроцитов. Нормобласты также преобразовываются в эритроциты.

Анализ на ретикулоциты назначают в случаях:

  • При контроле лечения заболевания анемии и применения препаратов (содержащие железо и медикаменты, в состав которых входит фолиевая кислота и витамин группы В12;)
  • При оперативном вмешательстве и трансплантации костного мозга;
  • Если существует подозрение на разрушение клеток эритроцитов;
  • Для контроля эффективности терапии системы кроветворения;
  • После потери большого объема крови;
  • Кровотечение во внутренних жизненно важных органах;
  • При лечении укуса ядовитой змеи и болезни малярия;
  • При трансплантации органа почки;
  • Контроль над приемом медикаментозного препарата эритропоэтин;
  • При онкологических заболеваниях;
  • Метастазы в клетках костного мозга онкольного.

При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге. Часть ретикулоцитов выходит в периферическую кровь и превращается там в зрелые эритроциты. Полагают, что окончательное их созревание происходит в течение нескольких часов.

В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов. Некоторые авторы отмечают, что у женщин количество ретикулоцитов несколько большее, чем у мужчин. У детей в первые дни жизни количество ретикулоцитов по разным данным может достигать 5 — 10%, а затем уменьшается.

Ретикулоцитоз

Ретикулоциты являются важным показателем регенераторной способности костного мозга. Увеличение их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается при гемолитических анемиях, когда число их может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах), при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), малярии, полицитемии, при лечении железом железодефицитных анемий, через несколько дней (3 — 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии, при остром недостатке кислорода. Наличие повышенного количества ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных брюшным тифом, язвенной болезнью).

Считается, что увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови является выражением хорошей регенерации только в том случае, если одновременно имеется ретикулоцитоз и в костном мозге, что называют истинным ретикулоцитозом. Отсутствие же повышенного количества ретикулоцитов в костном мозге при повышении их количества в периферической крови говорит об усилении вымывания ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь (ложный ретикулоцитоз).

Ретикулоцитоз, без соответствующей эритронормобластической реакции костного мозга, наблюдается при раздражении отдельных участков его раковыми метастазами или воспалительными очагами.

Ретикулоцитопения

Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях; анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии); талассемии; сидеробластной анемии; при метастазах рака в кость; лучевой болезни; лучевой терапии; лечении цитостатиками.

Подсчет ретикулоцитов в мазке крови

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

После потери ядра эритроциты воспринимают только кислые красители, и световая микроскопия не обнаруживает у них никаких внутриклеточных структур, позволяющих отнести форменные элементы к молодым или зрелым видам. Однако найти ретикулоциты можно, применив специальные методы окраски. Суправитальная окраска бриллианткрезиловым синим или акридиновым оранжевым, выявляющая базофильную субстанцию — гранулярные или нитевидные образования, помогает вычленить в мазке из общей массы (1000 клеток) красных кровяных телец молодые формы – ретикулоциты.

Между тем, имея в цитоплазме свойственную ретикулоцитам сетчатую субстанцию, которая определяет название клеток (substantia reticulofilamentosa), не все они «одинаковы с лица», поэтому их разделяют на 5 групп, каждая из которых имеет свои особенности расположения базофильного вещества (БВ):

  1. Ядерные ретикулоциты, получившее свое название из-за расположения БВ в виде венчика или ядра.
  2. Клубкообразные клетки – БВ напоминает глыбки или клубок.
  3. Полносетчатые ретикулоциты – базофильное вещество представлено густой сеткой;
  4. Неполносетчатые формы — БВ осталось как отдельные нити.
  5. Пылевидные ретикулоциты — мелкие зернышки в клетках и есть базофильная субстанция.

Принцип . Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-сетчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы . Можно использовать один из следующих красителей: 1) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном этиловом спирте. Для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса. На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски;

2) раствор азура 1 по П. Н. Корикову: азур I — 1 г; аммония оксалат — 0,4 г; натрия хлорид — 0,8 г; 96% этиловый спирт— 10мл; дистиллированная вода — 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр.

https://www.youtube.com/watch?v=https:accounts.google.comServiceLogin

Раствор хранят в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать; 3) раствор азура II: азур II — 1 г; натрия цитрат — 5 г; натрия хлорид — 0,4 г; дистиллированная вода — 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Ход определения. Окраска на стекле. Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки.

Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее топкий мазок и немедленно помещают во влажную камеру на 3–4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты, марли или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция — в синий цвет.

Окраска в пробирке. Методика 1 : перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на 1 каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски (реактив 1). В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 2 : в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20–30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 3 : в пробирку вносят 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5—6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1,5 ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1,5–3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов . В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция — в синий или синеватофиолетовый цвет.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 7×, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

  1. Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
  2. Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
  3. Азур I.

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови. Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором).

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

https://www.youtube.com/watch?v=ytaboutru

Для этого способа применяют краску Алексеева. В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха. Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла.

С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом. Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении наминут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли.

Из последующих капель готовят тонкие мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течениеминут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Ретикулоциты, окрашенные по Алексееву

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

Ретикулоциты представляют собой молодые эритроциты с тонкой синей сетчаткой или зернистостью в цитоплазме. Эти клетки характеризуют активность красного кроветворения.

Для выявления подсчета ретикулоцитов пользуются методом суправитальной (прижизненной) окраски. На предметных стеклах делаются мазки краски бриллианткрезилблау в абсолютном спирте, а затем на покрытом краской стекле делают обычным образом мазок крови и помещают его на 3—5 минут во влажную камеру, после чего сушат и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Ретикулоциты — клетки, которые характеризуют повышенную выработку эритроцитов в костном мозге.

Они в большом проценте появляются в периферической крови при гипохромной анемии («злокачественной анемии»), при гемолитической анемии и др. заболеваниях. Пониженное содержание ретикулоцитов и полное их исчезновение в периферической крови наблюдаются при обострении гиперхромной анемии.

Для предупреждения агрегации (склеивания) кровяных пластинок прокол кожи делают через каплю 14% раствора сернокислой магнезии, нанесенной на палец. Кровь смешивают с магнезией и готовят тонкие мазки на предметных стеклах, которые затем фиксируют и окрашивают по Романовскому в течение 2-х часов.

Принцип метода

  1. Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.
  2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.
  3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В большинстве отечественных лабораторий подсчет ретикулоцитов производится в мазке после окраски их специальными красителями. Этот метод прост, экономичен, не требует наличия специального дорогостоящего оборудования, а потому может использоваться в любой клинико-диагностической лаборатории.

https://www.youtube.com/watch?v=ytdevru

Второй и третий методы подсчета ретикулоцитов также достаточно просты, но гораздо дороже с экономической точки зрения — требуют дорогостоящего оборудования (люминесцентный микроскоп и гематологический анализатор, проводящий подсчет ретикулоцитов) и реактивов, а потому могут использоваться лишь в некоторых лабораториях.

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

1. Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте раствор азура I раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминисцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминисцентного микроскопа и специальных красителей, всвязи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpolicyandsafetyru

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесители в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H.Wallace и Joseph R. Culter в 1947 году. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода.

Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

1. Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией).

2. Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией).

3. Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией).

4. Незрелая фракция ретикулоцитов (IFR%, Immature Reticulocyte Fraction).

https://www.youtube.com/watch?v=ytcreatorsru

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности косного мозга.

Методика (анализатор Sysmex-XT-2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюорсцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения.

В настоящее время используется унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их
  • бриллиантовым крезиловым синим,
  • азуром I или
  • азуром II непосредственно на стекле или в пробирке.

1. Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции эритроцитов при окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

а) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса): 1,2 г краски на 100 мл спирта;

б) раствор азура I: азур I — 1 г, аммония оксалат — 0,4 г, натрия хлорид — 0,8 г, этиловый спирт 96% — 10 мл, дистиллированная вода — 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в тер- мостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать;

в) раствор азура II: азур II — 1 г, натрия цитрат — 5 г, натрия хлорид — 0,4 г, дистиллированная вода — 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

3. Окраска

  • хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте;
  • на приготовленные подобным образом стекла наносят каплю крови, делают тонкий мазок и сейчас же помещают стекло во влажную камеру. Для этого используют чашку Петри с крышкой, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты;
  • во влажной камере мазки выдерживают 3–5 мин, а затем высушивают на воздухе. Зернисто-сетчатая субстанция ретикулоцитов окрашивается в фиолетово-синий цвет, четко выделяясь на зеленовато-голубоватом фоне эритроцитов.
  • метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 40 мкл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
  • метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20– 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
  • метод 3: в пробирку помещают 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5–6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1½ ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1½ ч –3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.
  • Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом;
  • необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения;
  • практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр ×7, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

На предметное стекло с лункой наносят 2 капли 1 % раствора краски бриллиантового крезилового синего и 1 каплю крови. Осторожно перемешивают стеклянной палочкой и смесь помещают во влажную камеру (чашку Петри, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты) на 30 минут при комнатной температуре. Затем делают мазки и высушивают.

3. Окраска

Реактивы

Можно использовать один из следующих красителей:

  1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
  2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% — 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
  3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Клиническое значение определения количества ретикулоцитов

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски.

В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин. Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Среди методов определения гемоглобина наиболее широкое распространение получили методы, основанные на колориметрии, т. е. определении интенсивности окраски.

Наиболее простым из них является определение гемоглобина при помощи визуальной колориметрии в гемометре Сали, который представляет собой деревянный штатив с центральной градуированной пробиркой, по бокам которой расположены запаянные стеклянные трубочки с цветным стандартом (солянокислый гематин в глицерине).

В центральную пробирку предварительно наливают 0,1% раствор соляной кислоты до метки, соответствующей 2 или 3 г%, затем осторожно вносят (точно!) 0,02 мл крови, взятой из пальца специальной пипеткой, приложенной к гемометру. Поверхностным слоем кислоты промывают пипетку и, перемешав стеклянной палочкой кровь и кислоту, оставляют на 5 мин для образования солянокислого гематина.

Затем добавляя дистиллированную воду и постоянно перемешивая палочкой, добиваются полного совпадения цвета жидкости в центральной пробирке со стандартами. Концентрация гемоглобина соответствует отметке уровня раствора по нижнему мениску. Концентрацию гемоглобина можно выражать или в г% гемоглобина или в условных единицах. 16,67 г гемоглобина принято за 100 единиц.

Концентрация гемоглобина в крови у женщин бывает от 11,7 до 15,8 г°/о или от 117 до 158 г/л,-у мужчин — от 13,3 до 18 г% или от 133 до 180 г/л.

Скорость оседания эритроцитов определяется в крови, смешанной в соотношении 4:1с лимоннокислым натрием.

Реакция ставится в аппарате Панченкова. Капилляр Панченкова промывают цитратом натрия, затем набирают цитрат до метки 50, где стоит буква Р (реактив) и выдувают его в видалевскую пробирку. Этим же капилляром берут кровь дважды до метки К (кровь) и смешивают ее с цитратом. Смешанной с цитратом кровью заполняют этот же капилляр до деления 0 и ставят вертикально в штатив на час.

В норме СОЭ у мужчин равна 10 мм/ч, у женщин—14 мм/ч.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpressru

Скорость оседания эритроцитов повышается при воспалительных, острых и хронических заболеваниях, при злокачественных опухолях и других заболеваниях.

Литература:

  • Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. — Москва, «Медицина», 1987 г
  • Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы — «Клинические лабораторные исследования» — Москва, «Медицина», 1984 г.
  • Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы — «Клинические лабораторные исследования» — Москва, «Медицина», 1984 г.
  • Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва «Медицина» 1975 г.
  • Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. — Москва, «Медицина», 1987 г
  • Камышников В. С. Карманный справочник врача по лабораторной диагностике — Москва, «МЕДпресс-информ», 2007 год.
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Анализы и лечение. Помощь людям
Adblock
detector